精准检测糖尿病新指标——胰高血糖素失调

猛增医疗支出无力抵挡严峻风暴

全球糖尿病患者激增，由1980 年的1.08 亿增加到2015 年的4.15 亿，糖尿病医疗保健支出总额达6730 亿美元，占全球医疗费用的12%。全球糖尿病药物市场约600 亿美元，位居世界第二大药物种类。我国糖尿病患者高达1.1 亿人，目前糖尿病用药市场规模预计在213 亿元，由于存在发病率高、诊断率及治疗率低、控制率低、合并并发症机率高的特点，市场潜在空间巨大。

2017年已达到4.25亿，17年来患者人数增长近3倍。其中，中国患病人数达1.14亿人，糖尿病负担最重。超过3.5亿成年人目前处于发展为最普遍2型糖尿病(占总糖尿病患者的90%~95%)的高风险中，每两名糖尿病患者中就有一人未得到诊断，三分之二的糖尿病成年人是处于在职状态，超过800万的糖尿病成年人超过65岁，冷冰冰的数据再次提示糖尿病筛查和早期诊断及预防的重要性。

 

 

胰岛是高度血管化的器官，毛细血管网的密度大约是周围外分泌组织的5倍。胰岛能够迅速感知体内代谢环境的变化，通过分泌各种激素，调节机体代谢平衡。胰岛内主要分泌细胞包括α细胞、β细胞，分别产生分泌胰高血糖素、胰岛素。胰岛β细胞位于胰岛中央，胰岛α细胞包绕在β细胞周围，二者之间存在间隙连接， 细胞内的小分子可不经过细胞膜直接从一种细胞转运另外一种细胞而相互作用。

胰岛素和胰高血糖素对肝脏的应答是直接地拮抗作用，共同负责调节肝糖代谢。胰高血糖素受体是由7 个跨膜G 蛋白偶联形成，除分布于肝脏外，其在肾、脑、肠、脾、甲状腺、胰岛α和β细胞等组织细胞上均有广泛分布。肝脏不仅对胰高血糖素浓度的变化非常敏感，而且应答迅速，多数仅需8分钟即可被刺激应答；需要对胰高血糖素进行严格的监控，在血浆中胰高血糖素浓度的生理动态变化范围5mg/kg/min。

高水平的胰高血糖素是绝大部分糖尿病患者均会出现的高血糖的必要条件

无论是胰岛素绝对缺乏的T1DM还是相对缺乏的T2DM都存在相对低胰岛素血症和高胰高血糖素血症，造成的肝糖输出增加和血糖水平升高。

患者胰岛β细胞的分泌功能随时间延长呈进行性减退，导致其对胰高血糖素抑制减弱，胰高血糖素含量升高及胰岛β细胞功能受损加剧了餐后高血糖。

解剖证据揭示，在胰岛素到达体内其他任何受体之前，胰岛素就通过旁分泌到达α细胞的浓度远高于输送到外周组织的胰岛素受体的浓度水平。

为了防止胰高血糖素升高需要注射高浓度水平的外源性胰岛素而出现低血糖症，加重胰岛α细胞功能的损伤，表现为无先兆症状的低血糖昏迷。血糖波动不稳定，患者必须不间断地监测血糖水平；补充胰岛素或口服葡萄糖来应对和纠正高血糖或低血糖的情况是最具挑战性的日常临床问题。

 

 

检测胰高血糖素困难点

①氨基酸小，并且衍生物同源性极高【胰高血糖素（1-29）是通过用激素原转化酶2处理胰高血糖素原产生的，分子量为3485Da；胰高血糖素样肽-1（GLP-1），胰高血糖素样肽-2（GLP-2），肠高血糖素和胃泌酸调节素来源于激素原转化酶1处理的胰高血糖素原】，难以找到高特异性的抗体

②肽键不稳定，容易氧化、形成纤维化或淀粉化结构后聚集，各种蛋白酶也会对氨基酸基团降解

③半衰期为5～10min，主要在肝灭活

④检测试剂盒中校准品容易聚集，无法正常检测得到定量曲线

⑤需要的样本量大，样本通常需要经过纯化处理

 

 

放射免疫测定胰高血糖素固有问题

到目前为止，胰高血糖素通常用放射免疫测定（RIA）试剂盒进行测量，此试剂盒使用针对胰高血糖素C末端区域的多克隆抗体。然而，胰高血糖素原片段与胰高血糖素（1-29）具有相同C-末端区域；而且该抗体与胃泌酸调节素、肠高血糖素、小胰高血糖素（19-29）、GLP-1、GLP-2和胃抑制性多肽（GIP）存在较大的交叉反应性，所以这种RIA试剂盒不能准确地测量血浆胰高血糖素（1-29）。放免法测量健康人空腹胰高血糖素范围数据宽泛且差异大，显示放免法在灵敏度和特异性方面存在固有的问题。

 

 

参加口服葡萄糖耐量试验后健康人（实线）和2型糖尿病患者（虚线）血浆葡萄糖（a）和胰岛素免疫应答（b）的变化情况1。

 

 

参加口服葡萄糖耐量试验后健康人（实线）和2型糖尿病患者（虚线）血浆胰高血糖素免疫应答的变化情况1。

目前临床专家普遍共识： 2型糖尿病患者的胰岛α细胞不适当地分泌胰高血糖素，胰岛α细胞功能异常表现为高胰高血糖素血症2。T2DM患者在禁食状态血浆胰高血糖素升高，进餐后不减少3。

但放免法1品牌和2品牌在0 min时测量胰高血糖素水平2型糖尿病患者（虚线）均低于健康人（实线），并且口服葡萄糖耐量试验过程的免疫应答均无显著变化，充分显示了放免法测量胰高血糖素结果不可信。

在0 min时Mercodia ELISA测量胰高血糖素2型糖尿病患者（虚线）高于健康人（实线）水平，并且两者均处于低浓度，符合临床共识。随口服葡萄糖耐量试验时间推移，健康人（实线）的胰高血糖素被抑制而降低；2型糖尿病患者（虚线）的胰高血糖素无法被抑制而反常增高，显示胰岛α细胞功能异常。

使用新型Mercodia的C和N末端胰高血糖素单克隆抗体夹心法酶联免疫吸附测定试剂盒获得更准确的胰高血糖素（1-29）测量结果，才能准确判断2型糖尿病的病理机制，制定治疗策略1。

创新性胰高血糖素检测的解决方案

挑战特异性——夹心法C和N末端特异性抗体

试剂盒利用只针对胰高血糖素（1-29）N末端的M5F9S抗体为捕获抗体； E6A11K抗体为HRP标记抗体。这夹心法的高特异性技术确保与其他同源衍生物的交叉反应性极低4。

 

 

品牌	灵敏度	测量范围 (pg/mL)	交叉反应性	样本量	是否需要测量前提取人血浆？
Mercodia	4pg/mL	5-414	肠高血糖素<0.8%	25μL	否
			胃泌素调节素<4.4%
			微型胰高血糖素<0.10%
			GRPP<0.0005%
			GLP-1(1-37)<0.30%
			GLP-1(1-36酰胺)<0.30%
			GLP-1(9-36酰胺)<0.30%
			GLP-1(7-37)<0.30%
			GLP-2<0.30%
A品牌	3pg/mL	2-2000	胃泌素调节素<5%	150μL血浆； 20μL提取血浆	是
			胰高血糖素1-18<0%
			胰高血糖素19-29<0%
B品牌	27pg/mL	14-10000	与肠胰高血糖素反应微弱	40μL	否

Mercodia的C和N末端胰高血糖素单克隆抗体夹心法酶联免疫吸附测定试剂盒吸引了不少国际上相关邻域专家对胰高血糖素研究产生了新的浓厚的兴趣，也发表了多篇引起国内外关注和思索的探索性文献。其中通过对完全切除胰腺的患者观察胰外胰高血糖素和餐后高胰高血糖素血症，证明了人胰腺外胰高血糖素的存在；正因为其试剂盒的高特异性，有效地区分胰高血糖素和肠高血糖素，研究证明了两者浓度水平不仅无相关性，而且肠高血糖素浓度水平远高于胰高血糖素，但以往使用放射免疫测定方法存在明显的交叉反应性，导致正常人空腹胰高血糖素范围数据宽泛且差异大。

 

 

合成胰高血糖素、胃泌酸调节素和肠高血糖素在各品牌试剂盒的缓冲液中特异性和添加回收率4

		r2			回收率（%）
品牌	肽	测试1	测试2	测试3	测试1	测试2	测试3
Mercodia ELISA	胰高血糖素	0.98	0.97	0.94	90	105	102
	胃泌酸调节素	0.36	0.10	0.90	3	6	4
	肠高血糖素	0.00	0.05	0.01	0	1	2
ELISA A品牌	胰高血糖素	0.97	0.95	0.96	95	107	101
	胃泌酸调节素	0.33	0.14	0.19	1	3	5
	肠高血糖素	0.10	0.09	0.11	2	5	3
ELISA B品牌	胰高血糖素	0.90	0.85	0.89	140	120	111
	胃泌酸调节素	0.33	0.21	0.24	7	10	12
	肠高血糖素	0.45	0.49	0.50	8	6	7

 Mercodia ELISA试剂盒缓冲液优异的添加回收率结果才能确保精确检测样品结果

合成胰高血糖素，胃泌酸调节素和肠高血糖素在人血浆中各试剂盒的特异性和添加回收率4

		r2			回收率（%）
品牌	肽	测试1	测试2	测试3	测试1	测试2	测试3
Mercodia ELISA	胰高血糖素	0.96	0.94	0.97	107	95	92
	胃泌酸调节素	0.40	0.20	0.22	4	7	5
	肠高血糖素	0.30	0.21	0.25	1	2	3
ELISA A品牌	胰高血糖素	0.94	0.89	0.91	71	77	74
	胃泌酸调节素	0.41	0.27	0.33	3	5	3
	肠高血糖素	0.09	0.11	0.27	0	2	0
ELISA B品牌	胰高血糖素	0.77	0.81	0.80	65	59	64
	胃泌酸调节素	0.10	0.14	0.12	4	5	6
	肠高血糖素	0.64	0.54	0.51	20	24	22

Mercodia ELISA检测人血浆良好的添加回收率结果才能保证检测样品结果的准确性

极低检出限——解决灵敏度难题

血液中胰高血糖素浓度很低，大约10 pmol/L（35 pg/mL）或者更低，血糖过低时胰高血糖素水平会上升至 20-30 pmol/L（70-105 pg/mL）, 当高血糖时会下降 1-2 pmol/L（3.48-7 pg/mL）5-6。虽然报道的胰高血糖素浓度的生理范围为 0-30 pmol/L（0-105 pg/mL）, 近年来商业化的试剂盒不能提供关于各种生理状态下足够灵敏的胰高血糖素检测数据。为了给科学家提供可以检测各种生理状态下的胰高血糖素试剂盒，新型Mercodia的C和N末端胰高血糖素单克隆抗体夹心法酶联免疫吸附测定试剂盒提供灵敏度为人胰高血糖素 1.5 pmol/L（5 pg/mL）和动物类胰高血糖素 2pmol/L（7 pg/mL），灵敏度显著优于其他试剂盒（灵敏度为 10 pmol/L 或更高），研究者 Bak et al 的研究表明：灵敏度>5 pmol/L（17 pg/mL）不应用于胰高血糖素的全面描述7。

克服样本量限制——10μL

对于样本量的要求也显著限制了胰高血糖素检测应用。过去，大小鼠分泌胰高血糖素动力学的研究受到测定方法（RIA）对样品量要求（100-700μl）的限制；而且测定的结果可能含有未知的胰高血糖素类似物如前胰高血糖素原（1-61），肠高血糖素和胃泌酸调节素；这些测定方法灵敏度不足以量化分泌被抑制时的数值，所以啮齿动物分泌胰高血糖素的动力学和引起分泌被抑制的机制研究受到很大的制约。新型Mercodia的C和N末端胰血糖素单克隆夹心法酶联免疫吸附测定试剂盒应用于大小鼠实验中只需要10μl血浆；而且该试剂盒的高灵敏度可靠地反映出葡萄糖的强有力地持续抑制作用，胰高血糖素在几分钟内发生快速的应答变化，以往的检测方法因性能缺陷无法反映出其分泌被抑制时的数值，为将来前沿性探索研究啮齿动物分泌胰高血糖素的调节机制铺平了道路。

多元化应用需求

从“实验室至临床”途径对于了解生理学和病理生理学过程非常重要，也发展了治疗方法。新型Mercodia的C和N末端胰高血糖素单克隆抗体的夹心法酶联免疫吸附测定试剂盒为扩大转化研究范围提供分析解决方案，为不同的样本类型提供相应的操作模式以管理其特性。

目前国际逐步利用创新性产品进行糖尿病患者准确调控监测，评估胰岛细胞功能；避免过量使用胰岛素等药物所导致低血糖症；准确掌握应激素水平，诊断多种常见病和并发症（急性心肌梗死、急性脑血管病、糖尿病肾病等）；全面的评价药物的效果，指导临床发现新药如GLP-1类似物（受体激动剂）、胰高血糖素拮抗剂、瘦素等。

参考文献

Toshihiro Matsuo.(2016)Postabsorptive hyperglucagonemia in patients with type 2 diabetes mellitus analyzed with a novel enzyme-linked immunosorbent assay.J Diabetes Investig 324-331

谷 丽，张梅，胰岛α细胞在糖尿病发病及治疗领域中的研究进展，中国糖尿病杂志2017年２月 第25卷第２期，181-184

Knop FK,Aaboe K,Vilsboll T,et al.Impaired incretin effect and fasting hyperglucagonaemia characterizing type 2 diabetic subjects are early signs of dysmetabolism in obesity.Diabetes Obes Metab,2012,14:500-510

Nicolai J. (2014)Hyperglucagonaemia analysed by glucagon sandwich ELISA: nonspecific interference or truly elevated levels?Diabetologia 57:1919–1926

Holst JJ.(1983) Molecular Heterogeneity of Glucagon in Normal Subjects and in Patients with Glucagon-Producing Tumours. Diabetologia 24:359-365.

Christensen M et al. (2011) Glucose-Dependent Insulinotropic Polypeptide: A Bifunctional Glucose-Dependent Regulator of Glucagon and Insulin Secretion in Humans. Diabetes 60:3103- 3109.

Bak MJ et al. (2014) Specificity and Sensitivity of Commercially Available Assays for Glucagon and Oxyntomodulin Measurement in Humans. Eur J Endocrinol 170:529-538

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文章摘自广州市济源生物科技股份有限公司